A traditional medicine, respiratory detox shot (RDS), inhibits the infection of SARS-CoV, SARS-CoV-2, and the influenza A virus in vitro
Brian Hetrick1, Dongyang Yu2, Adeyemi A. Olanrewaju1, Linda D. Chilin1, Sijia He1, Deemah Dabbagh1,Ghaliah Alluhaibi1, Yuan - Chun Ma3, Lewis A. Hofmann4, Ramin M. Hakami1 and Yuntao Wu1*
▋摘要
氛围：迄今自始为患全世界的新型冠状肺炎病毒病 (SARS-CoV-2) 已在 220 多个国家和地区大盛行，截至 2021 年 4 月初已导致大大约 1.28 亿人施打，大大约 280 万人丧命。这两项，尚无可有效率减低 COVID-19 伤人率的用药法则。我们研究课题了一种宗教性的中的药低剂量制剂——欲求肺毒低剂量液 (RDS) 的潜在抑制冠状肺炎病毒活命官能，该低剂量液主要成份为东方医学宗教性中的用做用药腹腔传染病的中的泡茶。
结果：RDS 减缓 SARS-CoV 快肺炎病毒、SARS-CoV-2 快肺炎病毒、结合肺炎病毒肺炎病毒-SARS-CoV-2(Ha-CoV-2) 假型肺炎病毒以及传染官能 SARS-CoV-2 和共通的 Ha-CoV-2 变型肺炎病毒 (B.1.1.7、B.1.351、P.1、B.1.429、B.1.2、B.1.494、B.1.1.207、B.1.258 和 B.1.1.298) 对双链内的施打。我们促使假定 RDS 可以这样一来灭活命 SARS-CoV-2 肺炎病毒表面的传染官能。此外，我们断定 RDS 还可堵托肺炎病毒肺炎肺炎病毒对双链内的施打。
结论：RDS 可尤其减缓口腔肺炎病毒施打。词条：SARS-CoV-2，COVID-19，冠状肺炎病毒，抑制肺炎病毒用药，欲求肺毒低剂量液，宗教性中的药，SARS-CoV，肺炎病毒肺炎，Ha-CoV-2，SARS-CoV-2 假型肺炎病毒
▋氛围
迄今自始为患全世界的新型冠状肺炎病毒病 (SARS-CoV-2) 已在 220 多个国家和地区大盛行，截至 2021 年 4 月初已导致大大约 1.28 亿人施打，大大约 280 万人丧命。这两项，尚无可有效率减低 COVID-19 伤人率的用药法则。新成现的 COVID-19 肺炎病毒病原体为冠状肺炎病毒 SARS-CoV-2[1]，是 SARS-CoV 在致使急官能排尿综合征系统官能冠状肺炎病毒种类中的的兄妹肺炎病毒[2,3]。SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 最初都是在中的国断定的；SARS-CoV 肺炎病毒于 2002 年 11 月初在广东省首次被断定[4-6]，SARS-CoV-2 则于 2019 年 12 月初在武汉首次被断定[1,7,8]。在中的国，这两次由冠状肺炎病毒引起的疫情中的，中的药原则上被尤其应用做，用以应急应付冠状肺炎病毒引起的传染病。对于这两项的 COVID-19 大盛行，中的国有大大约 85% 的 SARS-CoV-2 施打病患接纳了宗教性中的医药麻醉药（9，10）。许多应用做的中的药确实带有有效率的抑制冠状肺炎病毒特官能并在医学上确实有效率，这个重要问题尚仍未得到充分答复。
中的药作为用药冠状肺炎病毒所引发传染病的有效率麻醉药，但由于缺少精子或体外的系统研究课题，其发展与确实应用做原则上受到了促使。为了已确定中的药的潜在抑制 SARS-CoV-2 活命官能，我们从常用中的药中的挑选了多种泡茶提炼物，并从中的药低剂量液 RDS(新泽西州一种实验室官能制品药品) 中的断定了抑制 SARS-CoV 和抑制 SARS-CoV-2 肺炎病毒的活命官能，一种在新泽西州的商贸制品药品。RDS 用做增强人体内排尿系统的总体肥胖，其构成多种泡茶成份，如大豆和千里光，它们是宗教性上用做管控增生和腹腔传染病的中的泡茶 (11-13)。在此，我们媒体报道 RDS 对 SARS-CoV、SARS-CoV-2 假肺炎病毒以及带有施打官能的野生型 SARS-CoV-2 肺炎病毒对双链内的施打带有减缓发挥作用。我们促使假定 RDS 可通过这样一来灭活命肺炎病毒表面或阻拦肺炎病毒侵入而减缓肺炎病毒的中期施打工程进度。此外，我们断定 RDS 还可以阻拦以次流肺炎病毒对双链内的施打。这些断定，RDS 对口腔肺炎病毒的施打意味著带有尤其的减缓发挥作用。
▋结果
为了从宗教性中的泡茶中的找寻潜在的抑制 SARS-CoV-2 活命官能，我们从大约四十种宗教性泡茶中的挑选提炼成 SARS-CoV-2S 酶假型快肺炎病毒[14,15] 和人体内腹腔 A549(ACE2) 双链内，此人类 ACE2 性状都会通过快肺炎病毒转导作为媒介酪氨酸，从而平稳转导来实现超暗示。快假型肺炎病毒应用做绿色激光酶 (GFP) 或激光伦酶 (Luc) 作为媒体报道性状，并通过了带有广谱抑制肺炎病毒转至减缓剂，以及科莫多尔 (Arbidol)[16]，和人类抑制毒血清对抑制 SARS-CoV-2(绘成 1a、C) 的假定。我们必需成功监测到科莫多尔 (Arbidol) 和抑制毒血清对于 SARS-CoV-2 假型肺炎病毒的减缓发挥作用，这是我们在其他四十余种宗教性泡茶提炼物检测中的没有断定的，之外其中的一些存有较高毒官能的泡茶 (绘成 1a-C)。然而，鉴于快官能假型肺炎病毒极少能监测 SARS-CoV-2 肺炎病毒的侵入行径，我们不必除去这些泡茶提炼物意味著有在转至后阶段必需减缓 SARS-CoV-2 的意味著官能。我们促使从宗教性抑制剂欲求肺毒低剂量液 (RDS) 中的挑选成了意味著的抑制 SARS-CoV-2 活命官能，该厂商不带有可有泡茶成份——、生物碱、大豆、千里光、老鹳草、苦杏仁、蜂房、皂角、银带花，在中的国宗教性上用做用药腹腔传染病 (11-13)。
不带有以次基果汁醛、3，4-二邻果汁氨基吗啡醛、以次基 3，4-二邻果汁氨基吗啡醛、原儿茶醛、以次基绿原醛和青藤草伦；花蕾中的还不带有苯甲醛 A、B 和 10 种据信环乙烯醚CHO苯甲醛[17]；该真菌还不带有皂甙甙 A 和 B，以及抑制增生发挥作用的苯甲醛 C[18,19]。生物碱醇苯甲醛中的不带有木脂伦、松脂醇和和生物碱苯甲醛[20]。大豆中的不带有被称之为大豆皂苯甲醛的甾体皂苯甲醛，是大豆分属真菌独有的真菌化学物[21,22]。白花千里光中的主要活命官能成份为四种单CHO，(−)-薄荷酚、(+)-普博利厄酚、(−)-柠檬乙烯和 (+)-薄荷磺醛；这种真菌还不带有其他化合物，如 1-辛乙烯-3-醇和、3-辛酚、β-月初桂乙烯和β-冬青乙烯[23]。老鹳草不带有大大约 162 种化合物，之外环乙烯醚CHO和环乙烯醚CHO苯甲醛、苯丙苯甲醛、有机醛、CHO类、糖类、黄吲哚、和皂苯甲醛[24]。苦杏仁中的不带有吲哚、乙乙烯化合物和胶原酶多糖[25]。皂角刺中的不带有皂苯甲醛和羽扇豆醛[26,27]，而银带花中的不带有主要活命官能成份银带花醛[28]。为了促使检测 RDS 的抑制 SARS-CoV-2 活命官能，用并不相同氢氧化钠pH的 RDS 程序中 A549(ACE2) 细胞内，然后让这些细胞内在存有 RDS 的完全接纳 4-6 两星期的施打。施打后，在不存有 RDS 的完全培育细胞内，然后在 48 和 72 两星期的时候，通过流型式细胞内拳法对肺炎病毒施打的减缓发挥作用展开假设。为了管控细胞内毒官能，应用做氰丙啶 (PI) 对即将丧命和已丧命的细胞内展开皮肤上，极少在活命细胞内群中的系统性 GFP+细胞内。如绘成 2 表，我们仔细观察到 RDS 对 SARS-CoV-2(GFP) 假肺炎病毒带有血糖反之亦然减缓发挥作用。为了猜测这些结果，我们应用做内源官能暗示 ACE2 的 VeroE6 细胞内每一次了该施打实验室。
(不知下页绘成)
ACE2 外部暗示，生产官能 SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 肺炎病毒可对其展开施打，ACE2 不一定用做冠状肺炎病毒的研究课题 (7)。受制于在缺少 ACE2 超暗示 [15，29，30] 的完全，假型肺炎病毒对 VeroE6 的施打官能较低，我们还应用做了激光伦酶媒体报道性状假型肺炎病毒，该肺炎病毒的媒体报道性状暗示由 HIV-1LTR 和 Tat 液压，带有更好的媒体报道性状敏感官能和信道。
绘成 2：RDS 减缓 SARS-CoV-2(GFP) 假型肺炎病毒施打 A549(ACE2) 细胞内。
A.A549(ACE2) 细胞内用 RDS 年终氢氧化钠 30 分钟后，用 SARS-CoV-2(GFP) 假型肺炎病毒施打。将细胞内浴去肺炎病毒和 RDS，并在不存有 RDS 的完全展开培育。流型式细胞内皓监测肺炎病毒施打减缓上述情况。仍未施打的细胞内和施打 SARS-CoV-2(GFP) 但仍无权 RDS 用药的细胞内作为对应。GFP+细胞内百份已标示出。(PI) 氰丙啶。
B.RDS 的细胞内毒官能系统性。A549(ACE2) 细胞内用 RDS 年终氢氧化钠 4 两星期，浴去 RDS，无 RDS 培育 48 两星期。氰丙啶皮肤上鉴定即将丧命细胞内和已丧命细胞内，流型式细胞内拳法系统性。插图血糖-重排细胞内毒官能双曲线，RDS 的半伤人pH (LC50) 比例为 1:11.9。
如绘成 3A 表，我们应用做 Luc 报告性状假肺炎病毒和 VeroE6 细胞内展开施打实验室，仔细观察到 RDS 对该肺炎病毒施打带有血糖反之亦然减缓发挥作用，并且至少减缓pH已确定为 1:230RDS 氢氧化钠度 (绘成 3B)。我们还假设了 RDS 对 VeroE6 细胞内活命力的影响，已确定了 50% 细胞内丧命血糖为 1:11.8RDS 氢氧化钠度。
绘成 3：RDS 对 SARS-CoV-2(Luc) 假肺炎病毒和野生型 SARS-CoV-2 肺炎病毒的血糖反之亦然减缓减缓发挥作用。用 RDS 年终氢氧化钠程序中 A、BVeroE6 细胞内，他用 SARS-CoV-2(Luc) 假型肺炎病毒施打。将细胞内浴去肺炎病毒和 RDS，并在不存有 RDS 的完全展开培育。在施打后 72 两星期用激光伦酶监测肺炎病毒施打的减缓发挥作用。仍未施打细胞内和 SARS-CoV-2-luc 施打但仍无权过 RDS 用药的细胞内作为对应。实验室每一次三次。插图血糖重排双曲线和 RDS 的 I-C50 氢氧化钠比例为 1:230。CRDS 对 VeroE6 细胞内的细胞内毒官能也通过氰丙啶皮肤上和流型式细胞内拳法系统性。用 RDS 年终氢氧化钠 4 两星期，浴去 RDS，在不不含 RDS 的完全培育 72 两星期。插图细胞内毒官能血糖-重排双曲线，RDS 的半伤人pH (LC50) 比例为 1:13.8 氢氧化钠。DRDS 减缓传染官能 SARS-CoV-2 施打。用年终氢氧化钠的 RDS 程序中 VeroE6 细胞内，并在 RDS 存有的完全施打 SARS-CoV-2。施打 48 两星期后，通过血菌斑系统性肺炎病毒释放后的肺炎病毒激活命减缓上述情况。减缓试验车一型式四份展开，并在 Prism7(Graph Pad) 中的应用做单向方差 (One-Way ANOVA) 系统性及 Dunnett 后检验 (Dunnett's Post Test)，以此已确定粗略估计显着官能。明显官能参数用星号问到如下：*p
为了促使假定应用做假肺炎病毒获的结果，我们检测了 RDS 对于 SARS-CoV-2 施打的堵托传染官能潜能。如绘成 3D 表，RDS 同时也堵托了 SARS-CoV-2 对 VeroE6 细胞内的施打。RDS 在氢氧化钠 1:40 以上时可明显缩减肺炎病毒黄褐色的成型。
综上，通过 SARS-CoV-2 假肺炎病毒与传染官能肺炎病毒的断定，RDS 不带有减缓 SARS-CoV-2 施打的活命官能成份，意味著是通过这样一来灭活命肺炎病毒或堵托肺炎病毒的中期施打工程进度。
为促使研究课题意味著的组态，我们将传染官能 SARS-CoV-2 肺炎病毒表面与年终氢氧化钠的 RDS 在 37°C 下预培育 1 两星期。随后，将结合物促使依次氢氧化钠-(10–1 至 10–4)，并转为 Vero 细胞内展开血菌斑系统性以已确定肺炎病毒施打官能的减低。如绘成 4A 表，我们仔细观察到在 RDS 中的短暂暴露一两星期后的肺炎病毒表面，其 SARS-CoV-2 的施打效价也红褐色血糖反之亦然增高。该结果猜测了 RDS 可有效率这样一来灭活命 SARS-CoV-2 肺炎病毒表面的传染官能。
我们促使检测了 RDS 确实也能减缓 SARS-CoV-2 肺炎病毒变型的施打。为此，我们借助最近研发的结合以次肺炎病毒-SARS-CoV-2 假型肺炎病毒 (Ha-CoV-2)[31] 来氢化一三部 S 酶类似于，之外英国政府类似于 (B.1.1.7)，南非类似于 (B.1.351)，乌拉圭类似于 (P.1)，南特州类似于 (B.1.429)，和其他几个新兴类似于 (B.1.2，B.1.494，B.1.1.207B.1.258，B.1.1.298)。Ha-CoV-2(Luc) 和系统官能 S 酶个体差异体在 37°C 年终氢氧化钠 RDS 培育 1 两星期。随后，用该结合物施打 HEK293T(ACE2/TMPRESS2) 双链内。施打后 12 两星期，激光伦酶测成肺炎病毒施打的减缓发挥作用。如绘成 4B 表，我们还仔细观察到了 RDS 对 Ha-CoV-2(Luc) 和所有 S 酶类似于的血糖反之亦然减缓。
我们还检测了 RDS 堵托 SARS-CoV 施打的潜能，应用做带有 SARS-CoV 突刺酶的 GFP 媒体报道性状快肺炎病毒和[15] 伪血糖。我们将人 A549(ACE2) 细胞内用作双链内，将其用三部氢氧化钠的 RDS 程序中，然后用 SARS-CoV(GFP) 报告性状假肺炎病毒施打 4-6 两星期。施打后在不不含 RDS 的完全培育细胞内，流型式细胞内拳法假设监测其对肺炎病毒施打的减缓发挥作用。或多或少，应用做氰丙啶除去即将丧命与已丧命的细胞内，极少在活命细胞内群中的系统性 GFP+细胞内。如绘成 5A 表，我们仔细观察到 RDS 对 SARS-CoV(GFP) 假型肺炎病毒的减缓发挥作用红褐色血糖反之亦然。我们促使猜测了这些结果，并假设了 RDS 酪氨酸的减缓与 Luc 媒体报道性状 SARS-CoV 假型肺炎病毒，SARSCoV(Luc)。我们仔细观察到 RDS 对 SARS-CoV(Luc) 和的减缓发挥作用红褐色血糖官能仰赖，其半减缓pH (IC50) 为 1:70.88 氢氧化钠度 (绘成 5B，C)。受制于 SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 都应用做 ACE2 施打双链内，我们还检测了 RDS 的抑制肺炎病毒活命官能确实极少针对与 ACE2 有相互发挥作用的冠状肺炎病毒。为此，我们监测了一种不系统官能的负链 RNA 肺炎病毒--肺炎病毒肺炎肺炎病毒。它通过肺炎病毒血凝伦 (HA) 和细胞内α-唾液醛来施打双链内。为了氢化肺炎病毒肺炎肺炎病毒，将暗示肺炎病毒肺炎 A/WSN/33(H1N1) DNA每个片断的 8 个媒介和一个 GFP-媒体报道性状共转染到 HEK293T 细胞内中的。在 RDS 存有的完全，整理肺炎病毒表面他用做施打目标 MDCK 细胞内。如绘成 6A 表，我们仔细观察到 RDS 对肺炎病毒肺炎肺炎病毒的减缓发挥作用红褐色血糖反之亦然。RDS 在 1:40 和 1:80 氢氧化钠时可完全堵托肺炎病毒施打，在 1:160 氢氧化钠时则可部分减缓肺炎病毒肺炎。RDS 对 MDCK 细胞内的半伤人pH (LC50) 经测成为 1:18.5(绘成 6B)。这些断定，RDS 的抑制肺炎病毒活命官能并非针对特定肺炎病毒，而意味著必需尤其减缓多种口腔肺炎病毒，如冠状肺炎病毒和肺炎病毒肺炎肺炎病毒。
▋研讨
在本报告中的，我们假定宗教性抑制剂欲求肺毒低剂量液 (RDS) 不带有广谱抑制肺炎病毒活命官能，可堵托 SARS-CoV、SARSCoV-2 和肺炎病毒肺炎肺炎病毒的施打。虽然 RDS 必需减缓多种肺炎病毒，但其抑制肺炎病毒活命官能因肺炎病毒类别和丙型肝炎而异。例如，对 SARS-CoV 快假肺炎病毒的 I-C50 pH为 1:7.9 氢氧化钠度，对 SARS-CoV-2 快假肺炎病毒的 I-C50 pH为 1:230 氢氧化钠度。对于传染官能野生型 SARS-CoV-2 肺炎病毒，I-C50 为 1:40 氢氧化钠度，对肺炎病毒肺炎，其 I-C50 为 1:250。RDS 对 Ha-CoV-2 及其变型有并不相同的减缓发挥作用，IC50 数参数从 1:70 到 1:2601 氢氧化钠度不等 (绘成 4B)。
(不知下一页绘成)
绘成 4 RDS 对 SARS-CoV-2 和共通的 Ha-CoV-2 变型带有血糖反之亦然灭活命发挥作用。ASARS-CoV-2 表面特年终氢氧化钠的 RDS 在 37°C 下培育 1 两星期。随后，将结合物促使年终氢氧化钠，并转为 Vero 细胞内中的展开血菌斑系统性，以已确定肺炎病毒施打官能减低。减缓试验车一型式四份展开，并在 Prism7(GraphPad) 中的应用做单向方差 (One-WayANOVA) 系统性和 Dunnett 后检验 (Dunnett'sPostTest) 以此已确定粗略估计显着官能。明显官能参数用星号问到如下：*p
BHa-CoV-2(Luc) 和系统官能 S 酶类似于与年终氢氧化钠的 RDS 在 37°C 培育 1 两星期后，用结合物施打 HEK293T(ACE2/TMPRESS2) 双链内。施打后 12 两星期，激光伦酶测成肺炎病毒施打的减缓发挥作用。RDS 的 IC50 参数的氢氧化钠度为 1:177(wt)，1:828(B.1.1.7)，1:124(B.1.351)，1:88(P.1)，1:134(B.1.1.207)，1:2601(B.1.1.298)，1:70(B.1.258)，1:362(B.1.429)，1:163(B.1.494)，1:137(B.1.2)。
我们促使假定 RDS 可以减缓冠状肺炎病毒的中期施打工程进度。虽然具体上述情况的抑制肺炎病毒组态尚仍未确实，但 RDS 可以通过这样一来灭活命肺炎病毒表面或通过阻拦肺炎病毒侵入或堵托肺炎病毒侵入后的中期工程进度来阻拦肺炎病毒施打。在其他几种宗教性中的药中的也断定了抑制 SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 的活命官能。例如，一种少不知的宗教性中的药——银带花。
银带花根中的已假定不带有银带花醛伦，可减缓 SARS 肺炎病毒[32] 医学受控株的激活命。此外，另一种可用做用药口腔传染病的中的药——双黄连制剂，已标示出成在体外以血糖反之亦然方型式减缓 SARS-CoV-23CL 酶酶 (3CLpro) 活命官能。粉条儿菜苯甲醛和粉条儿菜伦拟作为双黄连堵托 3CLpro[33] 的有效率成份。
绘成 5 RDS 减缓 SARS-CoV 假型肺炎病毒对 A549(ACE2) 细胞内的施打。用年终氢氧化钠的 RDS 程序中 A、B 细胞内，用 SARS-CoV(GFP)(A) 或 SARSCoV(Luc)B 假型肺炎病毒施打。将细胞内清浴，特到肺炎病毒和 RDS，在不存有 RDS 的完全展开培育。在施打后 48 两星期和 72 两星期，通过流型式细胞内拳法或激光伦酶监测来系统性肺炎病毒施打的减缓发挥作用。实验室每一次三次。插图血糖响应双曲线，并插图 RDS 的 IC50 参数为 1:70.9 氢氧化钠度 (C)
绘成 6 RDS 减缓以次流肺炎病毒对 MDCK 细胞内的施打。(A) 用年终氢氧化钠的 RDS 程序中 MDCK 细胞内 30 分钟，然后用以次流肺炎病毒 (GFP) 对其展开施打。施打后，在 RDS 存有下培育细胞内。36 两星期后用流型式细胞内皓对肺炎病毒施打的减缓发挥作用展开系统性。把仍未施打的细胞内与被以次流肺炎病毒 (GFP) 施打但仍无权 RDS 解决问题的细胞内展开对比。绘成中的标示出了 GFP+细胞内的百份。PI 问到氰丙啶 PI。
(B) 另外还应用做了 MTT 测成法系统性了 RDS 对 MDCK 细胞内的毒官能，插图了细胞内毒官能的血糖-重排双曲线，经计算，RDS 的至少伤人pH为 1:18.5 氢氧化钠度 RDS 的有效率抑制肺炎病毒成份尚仍未已确定。然而，RDS 并不相同于粉条儿菜苯甲醛和粉条儿菜伦，RDS 可以通过这样一来灭活命肺炎病毒量子来堵托肺炎病毒施打 (绘成 4)，而粉条儿菜苯甲醛和粉条儿菜伦则在肺炎病毒一段时间内的后期通过堵托肺炎病毒酶酶的活命官能来发挥发挥作用。然而，RDS 的体外抑制 SARS-CoV-2 活命官能仍需在今后的类动物研究课题和人类医学试验车中的得到猜测。迄今，我们即将展开小型类动物实验室，以已确定 RDS 在精子堵托 SARS-CoV-2 肺炎病毒施打的潜力。
▋结论
我们的研究课题断定，RDS 可尤其减缓口腔肺炎病毒的施打，如 SARS-CoV、SARS-CoV-2 和肺炎病毒肺炎。
▋法则
细胞内和化学合成
HEK293T (ATCC 普尔奇克，弗吉尼亚) MDCK (ATCC 普尔奇克，弗吉尼亚)，VeroE6 (ATCC 普尔奇克，弗吉尼亚) 和 A549 (ACE2) (来自 Virongy LLC 获赠，普尔奇克，弗吉尼亚)，和 HEK293T (ACE2/TMPRESS2) (来自 Virongy LLC 获赠，普尔奇克，弗吉尼亚) 迄今遗留于 Dulbecco's modifiedEagle's medium (DMEM) (赛默飞世尔科技领域 Thermo Fisher Scientific) 不带有 10% 热灭活命 FBS 和 1×青霉伦-链霉伦 (赛默飞世尔科技领域 Thermo Fisher Scientific)。在 HEK293T (ACE2/TMPRESS2) 化学合成基中的分别以 1μg/ml 和 200μg/ml 的pH转为嘌呤霉伦和潮霉伦 B。
真核生物转染和肺炎病毒氢化
不含 SARS-CoVS 酶或 SARS-CoV-2S 酶的快官能假型肺炎病毒表面由 Virongy LLC (Manassas，VA) 之外，或按照前面刻画的法则[15] 氢化。简言之，为了氢化 GFP 媒体报道性状快官能假肺炎病毒，HEK293T 细胞内与暗示 SARS-CoVS 酶或 SARS-CoV-2S 酶的媒介、pCMVΔR8.2 和 pLKO.1-puro-TurboGFP 共转染。为了产成激光伦酶媒体报道性状快官能假型肺炎病毒，将 HEK293T 细胞内与暗示 SARSCoVS 酶或 SARS-CoV-2S 酶的媒介、pCMVΔR8.2 和 pLTR-Tat-IRES-Luc 展开共转染。转染后 48 两星期整理肺炎病毒上清液，离心浓缩，−80℃ 遗留。野生型 SARS-CoV-2 肺炎病毒 (Isolate USA-WA1/2020) 由 BEI Bioresources (Manassas，VA) 之外。pHW-NAGFP (ΔAT6) 报告性状真核生物和 A/WSN/1933 H1N1 共通真核生物 pHW2000-PB2、pHW2000-PB1、pHW2000-PA、pHW2000-HA、pHW2000-NP、pHW2000-NA、pHW20000M 由 FengLi 芝特哥大学亲善之外。在肺炎肺炎病毒 A-GFP 媒体报道性状量子氢化中的，将 pHW2000-pb2、pHW2000-pb1、pHW2000-PA、pHW2000-ha、pHW2000-np、pHW2000-na、pHW2000-m、pHW2000-ns 和 pHW-NA-GFP 共转染 HEK293T 细胞内 (ΔAT6)。48 两星期后整理肺炎病毒上清液。SARS-CoV-2S、M、E、N 暗示媒介订制 Sinobiological。借助 Twist Bioscience 催化了 Ha-CoV-2(Luc) 媒介和 S 酶个体差异媒介。Ha-CoV-2(Luc) 和 S 酶个体差异量子按照前面刻画法则[31] 展开氢化。
肺炎病毒施打和抑制剂减缓试验车
RDS(欲求肺毒低剂量液)(来自 Dejia Harmony 获赠，利斯堡，弗吉尼亚) 是由马芝特哥大学实验室室 (Burnaby，BC，Canada) 生产的一种商贸厂商。RDS 中的所有中的泡茶成份原则上合乎《中的国药典 2015 年版》「饮片」国际标准，之外有效率成份不含量及重金分属、农药附送监测。RDS 是一种中的药的共煮成剂，再度副厂商在气态状况下冷却。SARS-CoV-2 抑制血清由 LanceA. Liotta 牙医之外。将科莫朵尔盐醛盐 (Sigma) 新的胶体在二以次基亚砜 (Sigma) 中的。对于假型肺炎病毒施打，12 孔板中的的 A549(ACE2) 细胞内 (来自 Virongy LLC 获赠，普尔奇克，弗吉尼亚) 或 VeroE6 细胞内用 RDS 程序中 30 分钟，在 37℃ 下施打 4-6 两星期，然后在的制品培育基中的浴涤培育 48-72 两星期。对于 VeroE6 细胞内的施打，细胞内也被 CoV-2 假型肺炎病毒施打增强剂 (CoV-2PIE) (来自 Virongy LLC 获赠，普尔奇克，弗吉尼亚) 程序中后，在 37°C 下再继续解决问题 30 分钟。应用做 GloMaxDiscover 酶标皓 (Promega) 系统性细胞内裂解物的激光伦酶活命官能。对于野生型 SARS-CoV-2 施打，VeroE6 细胞内在 37°C 下用 RDS 程序中 30 分钟，然后用 MOI 为 0.05 施打 SARS-CoV-2 (Isolate USA-WA1/2020；BEI Bioresources) 在乔治沃克私立大学的 BSL-3 收容公共设施内停留 1 两星期。细胞内用 PBS 浴涤 2 次，用不含 RDS 的培育基培育 48 两星期。从上清中的提炼肺炎病毒，用 12 孔板培育的 Vero 细胞内单层中的的血菌斑试验车测成小瓶滴度。简言之，每个样品在完整的 Dul-becco's ModifiedEagle 培育基 (VWR) 中的氢化，构成 1X 青霉伦-链霉伦 (VWR)，并附特 10% 的 FBS(赛默飞世尔科技领域 Thermo Fisher Scientific)。然后将 200 微升的每种氢氧化钠液导电到 VeroE6 细胞内单层的三个重合孔上 1 两星期。然后用 1～2 ml0.6% 琼脂糖 (Invitrogen) 和一部分完整的 Eagle Minimal Essential 培育基 (VWR) 的结合物覆盖单层，不含 1X 青霉伦-链霉伦，并附特 10%FBS。48 两星期后，将单层上皮细胞相同在 10% 以次醛氯化钠中的 1 两星期，并去除覆盖的琼脂托。为了皮肤上黄褐色，转为不带有 20% 乙醇和的 1% 结晶银带涂料氯化钠 5 分钟，然后用去离子水浴涤。对于肺炎病毒肺炎肺炎病毒施打 MDCK 细胞内，在 37°C 下用 RDS 程序中 30 分钟，然后用 A-GFP 媒体报道性状肺炎病毒施打 6 两星期。用不含 RDS 的培育基浴涤细胞内，培育 36 两星期。GFP 暗示通过流型式细胞内皓系统性。(FACSCalibur，BD Biosciences).
对于 SARS-CoV-2 肺炎病毒表面的 RDS 灭活命试验车，将 100μl 年终氢氧化钠的 RDS 附特到 1 mlSARS-CoV-2 肺炎病毒原液 (3.65×105PFU/ml) 中的，再度 RDS 氢氧化钠为 1:20，1:40 或 1:80。也之外对应状况 (1 ml 肺炎病毒+100μl 培育基)。结合物在 37°C 下培育 1 两星期。随后，对结合物展开三部氢氧化钠以产生额外的 1:10、1:100、1:1,000 和 1:10,000 氢氧化钠度，并将年终氢氧化钠的样品转为 12 孔板中的的 Vero 细胞内中的，用做展开血菌斑测成系统性。黄褐色测成中的再度的 RDS 氢氧化钠度为 1:200 至 1:200,000；1:400 到 1:400,000；和 1:800 到 1:800,000 的 RDS 氢氧化钠液。
Ha-CoV-2(Luc) 和 S 酶个体差异量子按照前面刻画的法则[31] 氢化。对于 Ha-CoV-2(Luc) 的 RDS 灭活命，将 5μl 年终氢氧化钠的 RDS 附特到 45μlHa-CoV-2(Luc) 或类似于中的，再度 RDS 氢氧化钠度为 1:20、1:40、1:80、1:160 或 1:320。将结合物在 37°C 下培育 1 两星期，然后在 RDS 存有下施打 HEK293T (ACE2/TMPRESS2) 细胞内 12 两星期。应用做 GloMax Discover 酶标皓 (Promega) 系统性细胞内裂解物的激光伦酶活命官能。
细胞内毒官能系统性监测
用氰丙啶皮肤上和流型式细胞内拳法假设对 A549 (ACE2) 细胞内和 VeroE6 细胞内的抑制剂细胞内毒官能展开监测，如所述 (34)。应用做细胞内增殖羰基盒 I(MTT) (Sigma) 和制造商决定的方案对 MDCK 细胞内的抑制剂毒官能展开假设。简言之，将 MDCK 细胞内 (ATCC) 以每孔 1×-105 个细胞内的速度快施打到 12 孔板中的。化学合成隔夜后，通过 RDS 解决问题 1 天，然后在 MTT 上面羰基 (Sigma) 的培育基中的培育。将细胞内与上面羰基共同培育 4 两星期，再继续后续转为 MTT 增氯化钠。培育皿孵蛋清早，用 GloMax Discover 酶标皓 (Promega) 测成吸光度。
英文名称
SARS-CoV：致使急官能排尿系统症候群系统官能冠状肺炎病毒；SARSCoV-2：Severe 致使急官能排尿系统症候群系统官能冠状肺炎病毒-2；TCM：宗教性中的药；RDS：口腔瘦身低剂量液；Ha-CoV-2：结合肺炎病毒新冠肺炎病毒假肺炎病毒。
致谢
深受感动 FengLi 之外肺炎肺炎病毒暗示媒介，深受感动 LanceLiotta 之外抑制毒血清；深受感动 TedCi，HeSun，ZhigangGao，WanyingWu 的研讨与决定；深受感动 KevinCarter、MarkMamdar、RichKeurajian、KarenFreidouni 之外 RDS 和泡茶提炼物。
原作者贡献
此次实验室由 Y.W.，R.H. 和 L.A.H. 设计，由 Y.W. 撰稿，由 L.A.H. 编辑。B.H.，D.Y.，A.A.O.，L.D.C.，S.H.，D.D、GA 及 YM 执行了该实验室。所有原作者已阅读并批文再度稿件。
资金来源
本研究课题的补助来自于乔治沃克私立大学外部拨款 223741(DeJiaHarmony/Anti-SARS-CoV-2)，该赔偿金由德佳和畅 (DeJiaHarmony) 之外。
图表和涂层的可用官能
本研究课题中的产生或系统性的所有图表原则上构成在本文中的。羰基可从 Y.W 处利用。
发表声明
批文及参与准许
不一般而言
准许撰写
不一般而言
竞争利益
乔治沃克私立大学国家生物强攻和传染病中的心的 RMH 和 YW 已获了德佳和畅 (DejiaHarmony) 的研究课题资助，LAH 为德佳和畅兼任技拳法顾问并获了雇请。没有其他关系或活命动意味著都会影响到提交的管理工作。
原作者详细信息
1新泽西州弗吉尼亚乔治沃克私立大学系统生物学学院国家生物强攻和传染病中的心，普尔奇克 20110。
2VirongyLLC，弗吉尼亚普尔奇克。3新泽西州伯纳比，BCV5J0E5 马芝特哥大学实验室室 (Dr.Ma's LaboratoriesInc.)。4 新泽西州弗吉尼亚利斯堡世界卫生科学组织，20176。
收稿应于：2021 年 4 月初 7 日
接纳应于：2021 年 5 月初 10 日
线上撰写小时：2021 年 5 月初 29 日
供参考
1. Zhu N, Zhang D, Wang W, Li X, Yang B, Song J, et al. A Novel Coronirus from Patients with Pneumonia in China, 2019. N Engl J Med. 2020;382(8):727–33.
2. Wu Y, Ho W, Huang Y, Jin D, Li S, Liu S, et al. SARS-CoV-2 is an appropriate name for the new coronirus. Lancet. 2020;395(10228):949–50.
3. Gorbalenya AE, Baker SC, Baric RS, de Groot RJ, Drosten C, Gulyaeva AA, et al. Coroniridae Study Group of the International Committee on Taxonomy of Viruses. Nat Microbiol. 2020;5:536–44.
4. Drosten C, Günther S, Preiser W, van der Werf S, Brodt H-R, Becker S, et al. Identification of a novel coronirus in patients with severe acute respiratory syndrome. N Engl J Med. 2003;348(20):1967–76.
5. Ksiazek TG, Erdman D, Goldsmith CS, Zaki SR, Peret T, Emery S, et al. A novel coronirus associated with severe acute respiratory syndrome. N Engl J Med. 2003;348(20):1953–66.
6. Peiris JSM, Lai ST, Poon LLM, Guan Y, Yam LYC, Lim W, et al. Coronirus as a possible cause of severe acute respiratory syndrome. Lancet. 2003;361(9366):1319–25.
7. Zhou P, Yang X-L, Wang X-G, Hu B, Zhang L, Zhang W, et al. A pneumonia outbreak associated with a new coronirus of probable bat origin. Nature. 2020;579(7798):270–3.
8. Wu F, Zhao S, Yu B, Chen Y-M, Wang W, Song Z-G, et al. A new coronirus associated with human respiratory disease in China. Nature. 2020;579(7798):265–9.
9. Yang Y, Islam MS, Wang J, Li Y, Chen X. Traditional Chinese medicine in the treatment of patients infected with 2019-new coronirus (SARS-CoV-2): a review and perspective. Int J Biol Sci. 2020;16(10):1708–17.
10. Ling CQ. Traditional Chinese medicine is a resource for drug discovery against 2019 novel coronirus (SARS-CoV-2). Journal Integr Medicine. 2020;18(2):87–8.
11. Shan M-Q, Qian Y, Yu S, Guo S-C, Zhang L, Ding A-W, et al. Anti-inflammatory effect of volatile oil from Schizonepeta tenuifolia on carrageenininduced pleurisy in rats and its application to study of appropriate harvesting time coupled with multi-attribute comprehensive index method. J Ethnopharmacol. 2016;194:580–6.
12. Jung ID, Kim HY, Park JW, Lee CM, Noh KT, Kang HK, et al. RG-II from Panax ginseng C.A. Meyer suppresses asthmatic reaction. BMB Reports. 2012;45(2):79–84.
13. Wu W, Li R, Li X, He J, Jiang S, Liu S, et al. Quercetin as an antiviral agent inhibits influenza A virus (IAV) entry. Viruses. 2015;8(1):6. doi. org/
10. 3390/ v8010 006. 14. Belouzard S, Chu VC, Whittaker GR. Activation of the SARS coronirus spike protein via sequential proteolytic cleage at two distinct sites. Proc Natl Acad Sci USA. 2009;106(14):5871–6.
15. He S, Waheed AA, Hetrick B, Dabbagh D, Akhrymuk IV, Kehn-Hall K, et al. PSGL-1 inhibits the incorporation of SARS-CoV and SARS-CoV-2 spike glycoproteins into pseudovirus and impairs pseudovirus attachment and infectivity. Viruses. 2021;13(1):46. doi. org/ 10. 3390/ v1301 0046.
16. Boriskin YS, Leneva IA, Pecheur EI, Polyak SJ. Arbidol: a broad-spectrum antiviral compound that blocks viral fusion. Curr Med Chem. 2008;15(10):997–1005.
17. Kakuda R, Imai M, Yaoita Y, Machida K, Kikuchi M. Secoiridoid glycosides from the flower buds of Lonicera japonica. Phytochemistry. 2000;55(8):879–81.
18. Son KH, Jung KY, Chang HW, Kim HP, Kang SS. Triterpenoid saponins from the aerial parts of Lonicera japonica. Phytochemistry. 1994;35(4):1005–8.
19. Kwak WJ, Han CK, Chang HW, Kim HP, Kang SS, Son KH. Loniceroside C, an antiinflammatory saponin from Lonicera japonica. Chem Pharm Bull. 2003;51(3):333–5.
20. Din LB, Bedgar DL, Katayama T, Lewis NG. On the stereoselective synthesis of (+)-pinoresinol in Forsythia suspensa from its achiral precursor, coniferyl alcohol. Phytochemistry. 1992;31(11):3869–74.
21. Kim YS, Woo JY, Han CK, Chang IM. Safety ysis of panax ginseng in randomized clinical trials: a systematic review. Medicines. 2015;2(2):106–26.
22. Attele AS, Wu JA, Yuan CS. Ginseng pharmacology: multiple constituents and multiple actions. Biochem Pharmacol. 1999;58(11):1685–93.
23. Yu S, Chen Y, Zhang L, Shan M, Tang Y, Ding A. Quantitative comparative ysis of the bio-active and toxic constituents of lees and spikes of Schizonepeta tenuifolia at different harvesting times. Int J Mol Sci. 2011;12(10):6635–44.
24. Ren D, Shen Z-y, Qin L-p, Zhu B. Pharmacology, phytochemistry, and traditional uses of Scrophularia ningpoensis Hemsl. J Ethnopharmacol. 2021;269:113688.
25. Sefer F, Misirli A, Gülcan R, editors. A RESEARCH ON PHENOLIC AND CYANOGENIC COMPOUNDS IN SWEET AND BITTER KERNELLED APRICOT VARIETIES. 2006: International Society for Horticultural Science (ISHS), Leuven, Belgium.
26. Chong W, Feng XY, Zhen GZ, Dan L, Yue D. Inhibition of mast cell degranulation by saponins from Gleditsia sinensis–structure-activity relationships. Nat Prod Commun. 2009;4(6):777–82.
27. Li WH, Zhang XM, Tian RR, Zheng YT, Zhao WM, Qiu MH. A new anti-HIV lupane acid from Gleditsia sinensis Lam. J Asian Nat Prod Res. 2007;9(6–8):551–5.
28. Nazari S, Rameshrad M, Hosseinzadeh H. Toxicological effects of Glycyrrhiza glabra (Licorice): a review. Phytother Res. 2017;31(11):1635–50.
29. Meltzer B, Dabbagh D, Guo J, Kashanchi F, Tyagi M, Wu Y. Tat controls transcriptional persistence of unintegrated HIV genome in primary human macrophages. Virology. 2018;518:241–52.
30. Wang Z, Tang Z, Zheng Y, Yu D, Spear M, Iyer SR, et al. Development of a nonintegrating Rev-dependent lentiviral vector carrying diphtheria toxin A chain and human TRAF6 to target HIV reservoirs. Gene Ther. 2010;17(9):1063–76.
31. Hetrick B, He S, Chilin LD, Dabbagh D, Alem F, Narayanan A, et al. Development of a novel hybrid alphirus-SARS-CoV-2 particle for rapid in vitro screening and quantification of neutralization antibodies, viral variants, and antiviral drugs. bioRxiv 2020. doi. org/ 10. 1101/ 2020. 12. 22. 423965.
32. Cinatl J, Morgenstern B, Bauer G, Chandra P, Rabenau H, Doerr HW. Glycyrrhizin, an active component of liquorice roots, and replication of SARS-associated coronirus. Lancet. 2003;361(9374):2045–6.
33. Su H-x, Yao S, Zhao W-f, Li M-j, Liu J, Shang W-j, et al. Anti-SARS-CoV-2 activities in vitro of Shuanghuanglian preparations and bioactive ingredients. Acta Pharmacologica Sinica. 2020;41(9):1167–77.
34. Crowley LC, Scott AP, Marfell BJ, Boughaba JA, Chojnowski G, Waterhouse NJ. Measuring cell death by Propidium Iodide uptake and flow cytometry. Cold Spring Harb Protoc. 2016. doi. org/ 10. 1101/ pdb. prot0 87163.
编辑： 翟超男相关新闻
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